細(xì)胞分離常用方法

一、懸浮細(xì)胞的分離方法 
組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，zui簡(jiǎn)單的方法是采用1000r/min的TD4A低速離心機(jī)離心10分鐘，若懸液量大，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，但速度不能太高，延時(shí)也不能太長(zhǎng)，以避免擠壓或機(jī)械損傷細(xì)胞，離心沉淀用無(wú)鈣、鎂PBS洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)，若選用懸液中某些細(xì)胞，常采用離心后的細(xì)胞分層液，因?yàn)椋?jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。不同比重的分層液的配制和具體分離方法詳見(jiàn)淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)的章節(jié)。

二、實(shí)體組織材料的細(xì)胞分離方法  
對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。 
（一）機(jī)械分散法 
所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)（用九號(hào)針），使細(xì)胞通過(guò)針頭壓出，或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠（常用注射器鈍端）使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細(xì)胞雖然簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。

（二）消化分離法 
組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。

1、酶消化分離法 
酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶，其分離方法如下： 
（1）胰蛋白酶分散技術(shù)  
胰蛋白酶（簡(jiǎn)稱胰酶）是廣泛應(yīng)用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對(duì)蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開(kāi)，在常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同，對(duì)細(xì)胞的消化能力也不同，胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的作用，取決于細(xì)胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無(wú)機(jī)鹽離子、pH以及消化時(shí)間的長(zhǎng)短等。 
①細(xì)胞類型胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織,能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對(duì)含結(jié)締組織較豐富的組織,如乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無(wú)效，但若與膠原酶合用,就能增加其對(duì)組織的分離作用。 
②酶的活力市售的胰蛋白酶,其活力都經(jīng)過(guò)測(cè)定而有效，但配制時(shí)必須新鮮，需保存在低溫冰箱中，消化時(shí)的pH和溫度都要適宜，否則會(huì)影響活力，細(xì)胞的分散直接與酶的活力有關(guān)，zui終使用活力為1:200或1:250，56℃pH8.0時(shí)活力zui強(qiáng)。 
該酶為粉劑，保藏時(shí)要防潮，室內(nèi)溫度不宜過(guò)高，保存時(shí)間不能太長(zhǎng)，若粉劑結(jié)團(tuán)塊,說(shuō)明該部分受潮或失效。 
③酶的濃度胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%（活力1:200或1:250）,但遇到難消化的組織時(shí)，濃度可適當(dāng)提高，消化時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。濃度高對(duì)細(xì)胞有毒性，而較低濃度的胰蛋白酶在培養(yǎng)液中可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，若培養(yǎng)液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。 
④溫度一般認(rèn)為胰蛋白酶在56℃時(shí)活性zui強(qiáng)，但由于對(duì)細(xì)胞有損害而不能被采用，常使用的溫度為37℃，通常在37℃進(jìn)行消化比室溫作用快。 
⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性強(qiáng)分散快，細(xì)胞也容易被消化下來(lái)，消化分離細(xì)胞時(shí)PH只能選用7.6～8.0之間，否則對(duì)細(xì)胞有損傷。 
⑥無(wú)機(jī)鹽離子若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來(lái)配制胰蛋白酶時(shí)，可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制時(shí)應(yīng)采用無(wú)鈣鎂離子的PBS配制。 
⑦消化時(shí)間如果細(xì)胞消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可以損害細(xì)胞的呼吸酶，從而影響細(xì)胞的代謝，一般消化時(shí)間為20分鐘為宜，冷消化時(shí)使用低濃度消化液，于4℃也可。 
分離方法如下： 
①冷消化將取得的組織用Hanks洗三次，剪成碎塊大小為4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪組織，再加入0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放4℃，次日再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗2~3次，然后，加入少量營(yíng)養(yǎng)液吹打分散，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。 
②多次提取消化法多次提取消化法有以下三種： 
熱消化多次提取將剪碎的細(xì)胞塊加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分鐘，然后經(jīng)洗滌后用營(yíng)養(yǎng)液分散制成細(xì)胞懸液，按合適的濃度分瓶培養(yǎng)，然后將留下的未*消化的組織按上述方法操作，再消化提取細(xì)胞。 
冷消化多次提取方法同上，只是消化溫度為4℃。 
先熱消化后冷消化將組織塊先用胰蛋白酶于37℃下消化20分鐘經(jīng)洗滌后用營(yíng)養(yǎng)液分散，制成懸液，剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于4℃下，次日再提取細(xì)胞，分散成懸液，分瓶培養(yǎng)。

（2）膠原酶（Collagenase）消化法  
膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來(lái)的酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用，對(duì)細(xì)胞本身影響不大，可使細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制，即操作簡(jiǎn)便又可提高細(xì)胞成活率，zui終濃度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。此酶消化作用緩和，無(wú)需機(jī)械振蕩，但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本。 
經(jīng)過(guò)膠原酶消化后的上皮組織，由于上皮細(xì)胞對(duì)酶有耐受性，可能有一些上皮細(xì)胞團(tuán)塊尚未被*消化開(kāi)。成小團(tuán)塊的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長(zhǎng)，因此不必要再進(jìn)一步消化處理。 
鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學(xué)活性（見(jiàn)表4-1）和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時(shí)間（小時(shí)）有差異（見(jiàn)表4-2），以及兩者價(jià)格不等，有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用，同時(shí)還可加透明質(zhì)酸酶（對(duì)細(xì)胞表面糖基有作用），采用兩者的聯(lián)合消化作用，對(duì)分散大鼠和兔肝、癌組織非常有效。

表4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別 
項(xiàng)目胰蛋白酶膠原酶 
消化特性適用于消化軟組織適用于消化纖維多的組織 
用量 0.01%～0.5% 0.1～0.3mg/mL（200u/mL） 
消化時(shí)間 0.5～2小時(shí)（小塊） 1～12小時(shí)
pH 8～9 6.5～7.0 
作用強(qiáng)度強(qiáng)烈緩和 
細(xì)胞影響時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有影響無(wú)大影響 
血清、鈣、鎂離子有影響無(wú)影響

表4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時(shí)所需時(shí)間（小時(shí)）（0.5～1cm3） 
酶種類較硬組織軟組織
4℃室溫 37℃ 4℃室溫 37℃ 
胰蛋白酶（0.25%） 24～48 1～6 1～2 12～24 1～2 0.5～1 
膠原酶（200u/mL） 24 6 6.5 12 3 0.25 
兩者聯(lián)合（對(duì)沖） 12～46 12～24 4～12 12～24 6～12 1～2

除上述兩種zui常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年來(lái)，還有一種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細(xì)胞更佳。
2、非酶消化法（EDTA消化法）
EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑或Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對(duì)一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離，缺點(diǎn)是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀，有團(tuán)塊，常不單獨(dú)使用，但可與胰蛋白酶混合使用（1:1或2:1），不僅利于細(xì)胞脫壁又利于細(xì)胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。 
消化分離法的操作步驟： 
（1）剪切把組織塊剪碎，呈1~5mm3大小的組織塊。 
（2）加液漂洗將碎組織塊在平皿（或三角燒瓶）中用無(wú)鈣鎂PBS洗2-3次（采用傾斜，自然沉降法）。 
（3）消化加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或EDTA）于37℃水浴中作用適當(dāng)時(shí)間（中間可輕搖1~2次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。 
（4）棄去消化液采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。 
（5）漂洗將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應(yīng)，采用漂洗法洗2-3次后，加入*培養(yǎng)基。 
（6）機(jī)械分散采用吸管吹打或振蕩法，使細(xì)胞充分散開(kāi)后用紗網(wǎng)或3~4層無(wú)菌紗布過(guò)濾后分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘，吸上層細(xì)胞懸液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。